Обращусь я к "бичи"

Галина Костина
31 января 2005, 00:00

В ближайшем будущем подхватившему инфекцию не придется бежать к доктору - биочип справится с проблемой сам

"Пронзительный розовый закат завораживал и приковывал взгляд к окну. Слабый писк 'бичи' вернул меня к реальности. Одновременно вспыхнул световой сигнал на ногте мизинца. Это означало, что нужно тащиться в коридор, глядеть на экран главного компьютера, висевшего на стенке между старинными эстампами модного ныне художника Батынкова. Нет, пожалуй, лучше подождать еще несколько минут, пока программа, передавшая сообщение личному доктору, пришлет его рекомендации.

Но ответ появился сразу на дисплее валявшегося на тумбочке КПК - он получил информацию от встроенного в капилляр мизинца 'бичи'. Мой крохотный персональный биочип отреагировал на появление в крови первых антител и автоматически впрыснул порцию лекарства. Такое сообщение я прочитала на экране КПК вместе с дальнейшими рекомендациями. Вскоре на экране появился озабоченный вопрос доктора: 'Все в порядке?' - 'Да, док, спасибо. Похоже, сказался последний уик-энд'".

Возможно, через несколько лет такое начало литературного произведения не будет свидетельствовать о его принадлежности к научно-фантастическому жанру. Уже сегодня мои отнюдь не сведущие в биотехнологиях знакомые на вопрос о биочипах начинают уверенно рассуждать о некоем встроенном в человека миниатюрном устройстве, способном не только реагировать на биохимические изменения в организме, но и автоматически предпринимать ответные действия. Вполне вероятно, что рабочие биочипы - дело весьма недалекого будущего. Ведь от первой идеи создания "бичи" до нынешних, пусть и несовершенных образчиков, выпускаемых уже промышленным способом, прошло всего 15 лет.

На пороге диагностической революции

Нынешний биочип - это маленькая (от пары миллиметров) пластинка из стекла, пластика или кремния, вмещающая до нескольких десятков тысяч упорядоченно нанесенных микротестов на основе ДНК или белков для проведения множественного биохимического анализа. Вкупе с прибором-анализатором это мини-лаборатория, позволяющая быстро получать самые точные результаты. Технология может быть использована в клинической диагностике для определения вирусов и микроорганизмов, гормонов, аллергенов, наркотиков, любых биоактивных веществ в любых малых концентрациях; в биологических и медико-биологических исследованиях; в криминалистике; для исследований в области экологии и биобезопасности. Существуют два основных типа "бичи" - ДНК-чипы и белковые.

Сейчас основная доля производимых биочипов - ДНК-чипы. Они способны анализировать так называемые линейные молекулы - ДНК и РНК - к примеру, находить мутации в генах, сравнивая "больные" и "здоровые" ДНК, или отлавливать вирусные и бактериальные ДНК. Белковые чипы появились сравнительно недавно, с их помощью анализируют более сложные по форме, чем ДНК, различные белковые молекулы - антитела, антигены, гормоны, аллергены etc.

Как это часто бывает, инновационное решение появилось в точке пересечения двух не связанных доселе линий НТП. Прогресс в биотехнологии состыковался с прогрессом в сфере информационных технологий. Ученые-биологи так научились работать с ДНК и белками, что появилась возможность манипулировать ими в формате микроэлектронных технологий. От последних - размерчик биочипа: тоненькую пластинку полтора на полтора миллиметра едва увидишь на кончике пальца, но содержит она огромное количество информации. Из IT - и некоторые способы нанесения информации на чип: одни делаются с помощью роботов, наподобие тех, что штампуют электронные чипы, другие с помощью устройств вроде струйных принтеров. И хотя сама идея создания биочипов все же принадлежала биотеху, в последние годы, судя по доступным аналитическим материалам, в топ-список компаний, патентующих отдельные технологии, применяемые в биочиповых системах, входили в основном айтишные и электронные компании, такие как Hitachi, Matsushita и Fuji (лидером в производстве биочипов все же остается пока американская биотехнологическая компания Affymetrix). Впрочем, те же аналитики говорят о том, что в ближайшее время эта ситуация скорее всего изменится, поскольку биохимическая сторона проблемы будет приобретать все большее значение и в число топовых будут входить крупные фармакологические и биотехнологические компании. (Как пишет одно западное издание, нечасто увидишь на одном рынке соревнование за интеллектуальную собственность таких разных компаний, как Merck и Hitachi.) В частности, это связывается с тем, что фармакологи ведут активную охоту за новыми генами и белками, которые будут использоваться в биочипах. Именно биочипы должны помочь фармкомпаниям и в создании новых лекарств, и в их тестировании (в ближайшие пару лет темпы роста рынка биочипов в фармакогеномике прогнозируются самые высокие - более 70% в год). Пригодятся биочипы и для распознавания взрывчатых веществ, химического и биологического оружия, а также как средства идентификации для криминалистики и судебной медицины.

Так "случайно" совпало, что по НИОКРовским планам целого ряда транснациональных компаний, работающих в сфере высоких технологий и секретных лабораторий, в том числе военных ведомств разных стран, 2005 год должен стать годом широкого вывода на рынок первой генерации промышленных биочипов, отвечающих за съем информации для диагностики болезней и обнаружения опасных веществ.

Уже в этом году, по прогнозам аналитиков, емкость рынка биочипов достигнет миллиарда долларов, причем темпы роста рынка в последние пару лет превышают 30% в год. Пока львиная доля производимых чипов используется в исследовательских целях - для массового рынка биочипы еще достаточно дороги. Но соблазн внедрить их в практическую медицину слишком велик: ведь один только рынок клинической диагностики - это десятки миллиардов долларов.

С гордостью за державу отметим, что российские ученые не только одними из первых заявили о возможности создания биочипов, но и разработали вполне конкурентоспособные технологии: наши чипы могут стоить раз в пятьдесят дешевле, чем западные аналоги. Впервые у нас появился шанс ворваться в мировой хайтек, причем в один из самых динамично развивающихся и перспективных его сегментов.

Туберкулез, лейкоз и другие

Все началось в 1989 году, когда ученые Института микробиологии РАН им. Энгельгардта (ИМБ) во главе с академиком Андреем Мирзабековым первыми в мире опубликовали в одном из специализированных западных журналов статью о ДНК-микрочипах. Революционная идея наших биотехнологов появилась в процессе поиска более эффективного пути расшифровки генома человека. Открытие казалось настолько привлекательным, что Мирзабекова пригласили поработать в Аргонскую национальную лабораторию министерства энергетики США. Он согласился, но с условием, что там будет создана совместная с ИМБ лаборатория. В большой шестилетний проект (1994-2000 гг.) включились компании Motorola и Packard Instruments. Однако, хотя объявление о начале грандиозного проекта с инвестициями в 19 млн долларов было громким, его завершение оказалось тихим и скомканным - энгельгардтовцы вспоминают о нем с неохотой. Хотя за это время была создана первая генерация биочипов и оформлены совместные патенты, еще до истечения сроков договора начались сбои с финансированием. По словам сотрудников ИМБ, минэнергетики США решило засекретить работы и перекрыть к ним доступ иностранцев (Мирзабекову предлагали американское гражданство, но он отказался). Мирзабеков с большей частью сотрудников вернулся в Москву. Споров об интеллектуальной собственности у россиян и американцев сегодня нет, поскольку наши ученые уже в Москве разработали и запатентовали (как в России, так в Европе и США) новые, более прогрессивные биочиповые технологии. Но на пути - теперь уже чисто российского - проекта появилось еще одно препятствие.

Летом 2003 года вице-президент Международной организации изучения генома человека, чье имя "Нью-Йорк таймс" поставила на третье место в списке ученых, оказавших максимальное влияние на развитие высоких технологий XXI века, академик Андрей Мирзабеков умер в возрасте 66 лет. Как знать, будь жив сегодня Мирзабеков, судьба одной из важнейших его разработок, может быть, складывалась бы по-другому. Но так или иначе проект русского "бичи" был запущен и стал показывать первые результаты.

В конце прошлого года первый биочип ИМБ для определения устойчивости возбудителей туберкулеза к лекарственным препаратам получил государственный сертификат. Это значит, что новая технология становится полноправным методом в клинической диагностике туберкулеза.

- Жаль, что Андрей Дарьевич Мирзабеков рано ушел из жизни, так и не дождавшись этого дня. Наш центр участвовал в испытании системы диагностики определения чувствительности с помощью биочипов более пяти лет, - говорит руководитель отдела проблем лабораторной диагностики Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом профессор Аркадий Мороз. - Насколько я знаю, это не только первый в России, но и первый в мире чип по туберкулезу, разрешенный к практическому использованию. Я слежу за новинками, и в нашем центре собрано практически все современное диагностическое оборудование, касающееся диагностики туберкулеза. К сожалению, в белом фраке в России мы одни.

Мороз поясняет, что примерно из 800 туберкулезных диспансеров страны 795 пользуются так называемой классической методикой диагностики, которая занимает три месяца (месяца два растет сама культура микобактерии туберкулеза, потом еще две-три недели возбудитель проверяется на чувствительность к лекарственным препаратам). Такой методикой пользовался весь мир, пока не появилось оборудование, которое сокращает срок ожидания результатов вдвое или даже до месяца. Однако его стоимость - 50-70 тысяч долларов - не подъемна для наших медицинских учреждений. Как бы то ни было, и месяц для диагностики - срок нежелательный, поскольку больного могут потчевать в этот период тем препаратом, который "его" бактерии не угрожает, зато на другие органы ложится серьезной нагрузкой.

Главный научный сотрудник московского Центра по борьбе с туберкулезом лауреат госпремии по науке профессор Нина Дорожкова, комментируя разные методы диагностики, говорит: "Все, что было до биочипа, не идет ни в какое сравнение с ним. В предыдущих методиках есть элементы ручного труда, а значит, вероятность ошибок, к тому же это затягивает процесс. Чип же дает результат за сутки-двое. У нового метода практически максимальная точность".

Задача ускорить диагностику и "минимизировать" устройство, по словам Мороза, была выполнена специалистами ИМБ блестяще. По сравнению с довольно массивными диагностическими "шкафами", куда заправляются для анализа флаконы с культурами бактерий и прочей биохимией, биочиповая система куда компактнее. Она состоит из биочипа - крохотного квадратика со стороной 3 мм на лабораторном стеклышке, прибора-анализатора и компьютера с определенной программой, который в конечном итоге выдает лаконичное резюме: подтверждается ли наличие микобактерии туберкулеза, и если да, то чувствительна ли эта бактерия к двум основным противотуберкулезным препаратам. Пользуясь этим методом, адекватную терапию можно назначать в реальном, а не в архивном, как выражается Мороз, времени.

В разработке и производстве биочиповых систем диагностики принимает участие несколько лабораторий ИМБ и большой междисциплинарный коллектив - биологи, химики, физики, программисты, математики. В одной лаборатории ИМБ синтезируют необходимую "химию" (в частности, олигонуклеотиды), в другой с помощью роботов наносят гелевый раствор с ДНК или белками на чипы, в третьей конструируют различные анализаторы биочипов, работающие на основе флюоресцентных, хемилюсцентных, масс-спектрометрических методов: для исследований - с более сложными функциями, для клиник - попроще. В четвертой создают компьютерные программы. Ряд лабораторий работает над разнообразными чипами, в частности над еще одним вариантом биочипа для определения чувствительности не только к двум основным противотуберкулезным антибиотикам - рифампицину и изониазиду, но и к препаратам так называемого второго ряда, которые используются в том случае, если палочка Коха устойчива к двум первым. Также в институте готовят чипы для выявления таких инфекций, как ВИЧ, сифилис, гепатиты В и С в донорской крови. Есть разработки и для диагностики возбудителей особо опасных инфекций - сибирской язвы, чумы, туляремии, натуральной оспы, бруцеллеза.

ИМБ уже четыре года работает совместно с рядом онкологических клиник над созданием чипов, с помощью которых можно быстро определить форму лейкоза, от чего зависит выбор соответствующей терапии. Врач.гематолог Детского гематологического центра Екатерина Исаева говорит, что биочипы позволяют выявить "генетические поломки" при лейкозах в течение полутора дней, тогда как традиционные методы, занимающие от трех до десяти дней, еще и менее точны.

Кроме ДНК-чипов в институте трудятся и над созданием белковых чипов. Последнее - дело более сложное, поскольку белки куда капризнее ДНК, при манипуляции их трудно сохранить в жизнеспособном состоянии. Над этой задачей бьется еще одна группа российских ученых - в Гематологическом научном центре РАМН.

Дайте высохнуть капле

О разработке ГНЦ РАМН мы узнали благодаря Конкурсу русских инноваций, который "Эксперт" совместно с генеральным партнером АФК "Система" проводит уже четвертый год. Проект "Биологические чипы на основе иммуноглобулинов - медицинские диагностические технологии XXI века" стал одним из победителей прошлогоднего конкурса.

Ученые Гематологического центра заканчивают работу над белковым биочипом, с помощью которого можно будет быстро выявить с десяток урогенитальных инфекций. На подходе также биочипы для быстрого анализа на различные онкогены и аллергены.

Один из разработчиков белковых биочипов сотрудник ГНЦ РАМН Андрей Бутылин показывает пластинку размером полтора на полтора миллиметра, на которой умещаются несколько тысяч "знаковых" точек. "Представьте себе, что вы смотрите на чип с помощью анализатора вроде микроскопа и видите несколько ярко светящихся точек, - рассказывает Бутылин. - А я разъясняю, что у вас аллергия на шерсть, бананы и перо подушки, потому что в этих конкретных ячейках были нанесены специфические молекулы - антитела, связавшиеся с этими аллергенами". Бутылин сознательно упрощает объяснение, чтобы не загружать терминами и тонкостями технологии, которые диктуются сложностью работы с белками.

Биочип ГНЦ РАМН отличается от разработки Института молекулярной биологии способом нанесения белков на подложку. Если в ИМБ белок или ДНК помещается роботом в ячейку чипа в специальном гелевом растворе (также разработанном учеными ИМБ), то в Гематологическом научном центре используют технологию дальнего электронапыления. Придумал ее сотрудник Института биофизики РАН (ныне Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН), сейчас работающий по контракту в одном из университетов США, доктор физико-математических наук Виктор Морозов.

По словам Андрея Бутылина, Морозов виртуозно управляется с капризными белками. Его манипуляции с ними и привели к появлению ноу-хау. Отчасти Морозов использовал уже известный метод ближнего электронапыления, когда раствор с белками распыляется из капилляра на подложку под напряжением. Но в этом случае белки могут разрушаться при ударе о подложку. Морозов придумал отдалить от подложки капилляр, решив таким образом сразу две задачи. Во-первых, задачу сохранения белка (капля, отрываясь от капилляра, разлетается на множество микроскопических брызг, которые успевают высохнуть на пути к подложке. А высушенный белок сохраняется гораздо лучше). Во-вторых, издалека можно распылять раствор сразу на много чипов, используя трафарет - своеобразную решетку с дырочками. Этот трафарет накладывается на электропроводящую подложку. Раствор с белком, превращаясь на лету в практически сухое облако белковых ионов, попадает в дырочки, притягиваясь электрическим полем подложки. Затем решетка передвигается, а через капилляр распыляется раствор уже с другим белком. "Таким способом мы можем нанести до пятисот тысяч пятен белков за полминуты-минуту, - говорит Морозов. - К тому же при таком напылении размер пятна может быть чрезвычайно мал -. один-два микрона".

"Эта технология позволяет производить биочипы любого наполнения (будь то антитела, гормоны, аллергены) в промышленных масштабах - надежные, эффективные и дешевые", - рассказывает Андрей Бутылин.

Он отмечает, что белковые чипы по сути не являются альтернативой ДНК-чипам, хотя они могут иногда решать одну и ту же задачу, к примеру, выявления вируса. Зато в комбинации эти чипы могут решать уже ряд задач, в частности в онкологии. Поэтому в ГНЦ РАМН нацелены на создание таких универсальных анализирующих систем, которые могли бы работать как с белковыми чипами ГНЦ, так и с любыми другими белковыми и ДНК-чипами.

Игра на междисциплинарных горках

Казалось бы, наши ученые, ставшие лидерами в "бичи"-технологии и разработавшие конкурентные ноу-хау, позволяющие производить в почти промышленных масштабах дешевые (стоимость российских белковых и ДНК-чипов не превосходит 10 долларов) чипы и сравнительно дешевые анализаторы биочипов, могли бы побороться за свою долю на растущем мировом рынке. Однако пока ни в ИМБ, ни в ГНЦ к этому не готовы.

Классическая ситуация - сильные в науке, наши ученые оказываются слабы в том, что касается коммерциализации и продвижения на рынок. Сотрудники ИМБ на вопросы о потенциальных рынках часто напоминали, что они ученые, а не менеджеры, и последних у них, к сожалению, пока нет. На вопрос о возможных западных инвесторах замдиректора ИМБ Александр Заседателев отвечает уклончиво: "Опыт нашего взаимодействия с иностранными партнерами позволяет говорить о том, что есть немало вариантов обойти разработчиков и построить бизнес на чужой технологии. Мы хотели бы найти серьезного отечественного инвестора, чтобы все делалось в России". Переговоры уже ведутся, отметил Заседателев, и есть вероятность, что совместная с инвестором компания будет создана в этом году. Возможно, для освоения российского рынка, который не мал, но все же не идет в сравнение с мировым, отечественного инвестора и хватит. Но, как небезосновательно уверяют эксперты, выйти на мировой рынок биотеха частной российской компании чрезвычайно затруднительно. Частный инвестор, пусть даже достаточно сильный, вряд ли потянет такой проект. Японское, китайское и тайваньское правительства анонсировали инвестиционные программы в этом технологическом секторе, хотя достижения этих стран куда скромнее российских. Россия неоднократно отдавала на откуп другим странам свои ноу-хау. В данном случае это будет особенно обидно - несмотря на смерть Мирзабекова, школа есть, глобальный рынок "бичи", в отличие от того же офшорного софта, только начинает формироваться, и, last but not list, речь идет о любимой русской игре ума на междисциплинарных горках.

Как работает ДНК-чип

У больного берется анализ мокроты, в которой содержатся микобактерии туберкулеза (палочки Коха), и, соответственно, их ДНК. Однако количество ДНК в самой пробе достаточно мало, чтобы сразу "отловить" возбудителя туберкулеза. Чтобы "нарастить" ДНК, используют метод так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того что при ПЦР количество копий ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, во время этой реакции нити ДНК как бы расплетаются при нагревании (напомним, что ДНК представляет собой двухнитиевую спираль). Пользуясь методом ПЦР, можно копировать строго определенные участки ДНК. В нашем случае для копирования выделяются те участки, которые отвечают за идентификацию микобактерии туберкулеза и за чувствительность к лекарственным препаратам. Затем к полученным однонитиевым кусочкам ДНК ученые химически "пришивают" флуоресцентные метки. Эту смесь наносят на чип примерно со 100 ячейками, в каждой из которых в специальном геле находится определенный искусственно синтезированный олигонуклеотид (нить нуклеотидов в специфической последовательности). Каждый из олигонуклеотидов представляет собой потенциальную пару для нарезанных и помеченных ниточек ДНК. Чип помещают на ночь в термостат, где должен пройти процесс гибридизации или сцепления тех олигонуклеотидов и ниток ДНК микобактерии, которые будут комплементарны друг другу, проще говоря, найдут свою пару. После гибридизации чип отмывают водой, чтобы удалить те элементы ДНК, которые своей пары не нашли и могут мешать своими флуоресцентными метками. Биочип высушивают и вставляют в прибор-анализатор, который показывает, в какой ячейке происходит свечение, в какой нет, каков уровень свечения. Компьютерная программа анализирует картинку и выдает результат.